H19 Induces Abdominal Aortic Aneurysm Development and Progression

H19誘導腹主動脈瘤的發展和進展

期刊：Circulation；影響因子：18.88

發表單位：德國慕尼黑技術大學 

    lncRNA H19是一種新的SMC在AAA發展和進展中存活的調節因子，抑制其表達可能作為主動脈瘤疾病的新型分子治療靶點。

    lncRNA已成為各種生物過程和疾病中的關鍵分子調節劑。在這里，我們尋求識別和功能表征lncRNAs作為腹主動脈瘤（AAA）發展的潛在介質。在體內利用位點特異性反義寡核苷酸（LNA-GapmeRs）對H19進行實驗性敲低，顯著限制了兩種模型中的動脈瘤生長。上調的H19與進展性動脈瘤中的平滑肌細胞（SMC）含量和SMC凋亡相關。H19的體外敲低顯著降低了培養的人主動脈SMC的凋亡率，而H19的過表達具有相反的作用。定制的轉錄因子陣列將缺氧誘導因子1-α（HIF1α）鑒定為主要的下游效應子。另外，H19通過將轉錄因子特異性蛋白1（Sp1）募集到啟動子區來誘導HIF1α的轉錄。

    腹主動脈瘤（AAA）是腹主動脈的局部擴大，直徑大于3厘米，或超過正常大小的1.5倍，死亡率高達80％。動脈瘤的無癥狀特征使其評估具有挑戰性。不幸的是，到目前為止還沒有確定可以限制其進展或人類破裂風險的有效藥理學方法。臨床上，唯一可用的治療選擇仍然是外科手術，包括擴張主動脈的開放性或血管內主動脈修復術（OAR或EVAR）。獲得對驅動AAA發展和進展的細胞機制和調節網絡的更好理解對于鑒定新的治療靶標是必不可少的。

    我們在血管緊張素II（AngII）/ApoE-/-小鼠模型中進行RNA測序以鑒定動脈瘤發展期間的失調。在泵植入后7天收獲來自AngII處理的小鼠（n=4）或假對照（n=4）的腹主動脈組織。當使用PPE輸注在第二個實驗性AAA小鼠模型中交叉檢查上調的轉錄物時，H19和另外兩個lncRNA被鑒定為與模型無關的lncRNA。通過AngII誘導的AAA樣品中的RT-qPCR與對照相比證實了所有三種lncRNA的上調，其中H19上調最顯著（圖1b，c）。利用位點特異性反義寡核苷酸（LNA-GapmeRs）對H19進行全身體內敲低顯著限制了兩種鼠模型中的動脈瘤生長（圖1d，e），使用錯配的亂序寡核苷酸作為相關對照。原位雜交表明H19在未消化的非擴張主動脈的內側SMC和外膜成纖維細胞中表達。在AngII輸注后，H19表達在擴張的主動脈組織中的內側SMC中顯著升高。通過用GapmeRs抑制H19來消除這種增加。這些數據表明H19可能通過影響SMC動力學參與AAA的發展和進展。

    與我們的體內數據一致，AngII能夠在培養的主動脈SMC中穩健地誘導H19。AngII處理進一步誘導細胞凋亡，同時降低SMC的增殖率。這些作用均被H19敲低減弱，表明H19在AAA相關（AngII）條件下對SMC凋亡的調節作用。值得注意的是，這種促凋亡作用只能在較晚的時間點（48小時）觀察到，而不是在早期的急性反應期（8小時）觀察到。為了進一步評估H19調節在SMC中的細胞效應，我們使用了動態活細胞成像系統。首先，我們要么用LNA-GapmeRs抑制H19，要么在培養的人主動脈平滑肌細胞（hAoSMCs）中用pcDNA-H19依賴性過表達誘導H19。H19的過表達導致細胞凋亡增強和SMC的增殖以時間依賴性方式降低。敲除H19抑制SMC凋亡，但未觀察到對增殖率的顯著影響。

    越來越多的研究表明，H19可能作為miR-675的儲庫，其嵌入H19轉錄物的第一個外顯子中。因此，我們評估了miR-675在H19介導的對SMC的作用中的作用。 培養的hAoSMC用H19野生型載體（H19wt）或H19突變體轉染，缺失miR-675（H19 mut），并隨時間監測。H19 mut和H19 wt均誘導細胞凋亡并減少SMC的增殖。除此之外，通過qRT-PCR在AngII誘導的AAA中未觀察到miR-675表達的顯著差異。與H19不同，miR-675在來自患有AAA的人類患者的組織樣品中或在動脈瘤發育的兩個實驗鼠模型中的任一個中都沒有顯著失調。因此，在AAA發展過程中，H19對SMC的作用似乎與miR-675無關。

    為了探究H19如何調節SMC細胞凋亡，我們提出H19可能通過轉錄因子的改變來影響分子過程?；趯φ{節RNA元件的計算機分析，我們鑒定了包括HIF1α在內的幾種預測與H19相互作用的轉錄因子，然后使用定制設計的RNA陣列分析顯示HIF1α是唯一的差異調節因子。為了證實HIF1α介導H19的作用，我們使用siRNA誘導的HIF1α抑制。HIF1α的mRNA和蛋白質水平均被顯著阻斷。有趣的是，H19過表達以及AngII治療顯著增加了HIF1α的表達并因此在SMC中凋亡。通過抑制H19或HIF1α沉默可以消除這種作用。在HIF1α抑制后，SMC中的H19水平保持不變。重要的是，促凋亡蛋白Bcl-2相關X（BAX）顯示與HIF1α相同的模式，而抗凋亡介質B細胞CCL/淋巴瘤2（BCL2）顯示相反的趨勢，表明 AngII/H19誘導的SMC凋亡依賴于HIF1α表達的變化。

    我們用qRT-PCR評估了小鼠和人AAA樣品中HIF1α和凋亡相關基因的表達。如所預期的，H19，HIF1α和BAX均顯著增加，而抗凋亡蛋白BCL2在鼠AngII和PPE模型以及人主動脈瘤中顯著降低。H19的敲低充分抑制了HIF1α的表達并顯著限制了SMC凋亡。同樣，在人AAA樣品的SMC層中觀察到上調的H19和HIF1α的共定位以及與細胞凋亡的相關性。H19和HIF1α在兩種小鼠AAA模型中一致誘導，而已知HIF1α下游靶標的特定變化在不同的AAA模型中不一致，表明這些變化可能與模型相關而不是HIF1α依賴性。最后，通過PPE灌注在野生型（WT）或Ldlr-/-Yucatan小型豬中誘導AAA，類似于鼠模型。與假手術組相比，H19的表達顯著上調，同時PPE誘導的AAA中HIF1α的表達增強。

    我們利用原位雜交（ISH）和鄰近連接測定（PLA）評估H19和HIF1α之間的物理相互作用，，其中一旦兩個分子達到非常接近（<40nm）就可以檢測到放大的信號，這被認為是它們相互作用的證據。事實上，AngII治療以及H19過表達大大增強了H19和HIF1α之間的相互作用，主要在細胞質中。HIF1α是胚胎心血管發育所必需的，因此被認為是缺氧期間細胞存活的必要條件。在此過程中，誘導的HIF1α轉移到細胞核中并激活參與減少缺氧損傷的許多基因的轉錄。氯化鈷（CoCl2）是一種成熟的HIF1α的化學誘導劑，成功地增加了HIF1α的積累，并觸發其易位進入細胞核。有趣的是，H19減弱了易位并將HIF1α滯留在細胞質內，這表明H19結合細胞質HIF1α的這種直接相互作用可以刺激SMC凋亡并增強AAA進展。

    我們設計了生物素標記的ISH探針，靶向HIF1α啟動子區域，并利用基于PLA的相互作用檢測方法在細胞核中證實了Sp1和H19之間的相互作用模式。然后使用在啟動子區域含有HIF1α wt或Sp1結合位點突變體的熒光素酶報告基因測定法。觀察發現Sp1和H19過表達的組合處理顯著增加了轉錄活性，表明H19募集并促進Sp1與HIF1α啟動子區域的結合。在Sp1抑制劑mithramycine A存在下，這些作用被消除，進一步支持Sp1在這種情況下的轉錄作用。此外，HIF1α啟動子突變體的熒光素酶測定表明HIF1α啟動子區域中的兩個Sp1結合位點對于這些作用是必需的。此外，使用LongTarget工具分析預測H19-HIF1α結合模式。H19中該區域的缺失保留了促凋亡能力，但未能增強HIF1α轉錄活性。這些數據表明H19通過將Sp1募集到其啟動子區域來增強HIF1α轉錄。最后，染色質免疫沉淀（ChIP）測定能夠證實HIF1α啟動子中Sp1和H19的占據。

    總之，我們在AAA發展，其進展和終末期疾病中鑒定了功能相關的lncRNA。在SMC的細胞核中，增強的H19與HIF1α的啟動子區域結合并募集轉錄因子Sp1，其增強HIF1α的表達。同時，H19與HIF1α蛋白相互作用并將其保留在細胞質內，作為可阻斷促存活信號傳導的支架。增加的細胞質HIF1α直接與Mdm2相互作用并阻止Mdm2介導的p53減少，從而導致BAX升高和BCL2水平降低。這會引發SMC凋亡并加速AAA的發展和進展。

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