XACT Noncoding RNA Competes with XIST in the Control of X Chromosome Activity during Human Early Development 

在人類早期發育過程lncRNA XACT在控制X染色體活性上與XIST競爭

期刊：CellStemCell；影響因子：23.290 

發表單位：法國巴黎國家科學研究中心 

    lncRNA XACT在人體胚胎中影響XIST的積累，以防止X染色體沉默和功能性無效，并允許在關鍵發育階段的劑量補償的替代策略，而這種機制具有物種特異性。

    性染色體劑量補償在大多數后生動物中是必不可少的，但發育時間和潛在機制差別很大，甚至在胎盤哺乳動物中也是如此。在這里，我們確定了在早期胚胎發育中調節X染色體活性的人類特異性機制。單細胞RNA測序和成像揭示了早期人類植入前胚胎和幼稚人胚胎干細胞中活性X染色體上的長非編碼RNA（lncRNA）XACT和XIST的共激活和積累。在這些情況下，XIST RNA采用了一種不尋常的，高度分散的組織，這可以解釋為什么它在此階段不會觸發X染色體失活。轉基因小鼠細胞的功能研究表明，XACT影響順式XIST的積累。因此，我們的研究結果提出了一種機制，涉及XIST和XACT在控制早期人類胚胎X染色體活性中的拮抗活性，并強調快速進化的lncRNA對物種特異性發育機制的貢獻。

    在哺乳動物中，必須嚴格控制X染色體的活性以適應雄性和雌性之間X連鎖基因劑量的不平衡。這是通過補償機制實現的，這種機制可以平衡性別之間和相對于常染色體的X染色體表達。雖然X染色體劑量補償對于適當的發育是必不可少的，但是基礎策略在物種之間變化很大。例如，在小鼠中，X染色體失活（XCI）在合子基因組激活（ZGA）后迅速啟動，在胚泡植入之前進行了幾次分裂。相反，人類植入前發育在明顯缺乏XCI的情況下進行；相反，通過降低女性中兩條X染色體的表達來暫時實現劑量補償。這些差異背后的機制仍然知之甚少。

    我們分析了從人類植入前胚胎產生的四組獨立的單細胞RNA測序（RNA-seq）數據，我們根據用于分類胚胎的方法將其分為按發育階段（數據集1）和發育當天（數據集2）分類兩個數據集（圖1A）。合子XIST和XACT表達的主要爆發同時發生在四細胞和八細胞階段之間（圖1B）。在這些階段之前XIST是不可檢測的，而對于XACT有一個適度的母體貢獻。在雌性和雄性胚胎中，XIST和XACT的表達在發育的早期階段（從E3到E5的早期）強烈相關，表明在X上分開40 Mb的兩個非編碼基因可能是共同調節的。（圖1C;圖S1B）。然而，XIST-XACT相關性在后期胚胎中沒有持續存在（從E5到E7，圖S1D）。在女性中，XIST和XACT在外胚層（EPI和EPI-TE）和原始內胚層（PE）細胞中共表達。相反，滋養外胚層（TE）細胞顯示可變的XACT水平（圖1D），同時保持穩定的XIST表達。這種模式表明，一旦啟動，XIST和XACT的表達可以獨立調節，與XACT被抑制的分化細胞中無活性X染色體的XIST表達持續存在一致。

    雄性和雌性胚泡中XIST和XACT的同時RNA-FISH顯示兩種轉錄物通常從X染色體共表達并積聚在細胞核內的大區域中。然而，XIST和XACT RNA差異分布且兩個信號幾乎不重疊，表明XIST和XACT轉錄物占據不同的核區域。雖然XIST的表達從早期（B1）到晚期/孵化（B5）胚泡階段保持恒定，但是根據胚泡細胞數量，具有XACT和XIST共同積累的細胞的比例減少，與胚泡細胞亞群中XACT表達缺失一致。此外，當比較XIST和XACT的相對等位基因表達時，沒有發現復發模式，證實一旦激活，XIST和XACT可以獨立調節，并表明它們在胚泡中的表達具有一定程度的隨機性。

    我們探測了幼稚雌性H9 hESCs中X染色體的染色質模型。對XIST RNA-FISH組合的各種組蛋白標記的免疫熒光（IF）譜的共聚焦分析首先顯示在XIST RNA結構域內缺乏H3K27me3和H3K9me3，表明在這種情況下XIST積累不足以引發募集鎮壓組蛋白標記。對已發表的染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）數據集的分析證實，與表達XIST的致敏細胞中的Xi相比，幼稚hESC中X缺乏H3K27me3和H3K9me3富集。我們接下來通過RNA-FISH研究了幼稚hESC中的XACT表達。在大多數幼稚H9和WIBR3細胞中，XACT在每個X染色體上表達并積累，并且該模式在培養物中穩定維持。加強幼稚hESC和植入前胚胎之間的相似性，定性分析顯示，在Xs活躍的條件下胚胎和幼稚hESCs比在表達XIST的引發的hESC中更加分散的XIST RNA-FISH信號，其中XIST包被無活性的X染色體。XIST信號在幼稚與引發的多能細胞中的不同分布可能是其以順式沉默染色體的有限能力的基礎。

    在具有XACT BAC轉基因的克隆中特異性地檢測到XACT表達，并且在大多數克隆中，XACT在大部分細胞中形成RNA云。通過實時qPCR確定每個這些克隆的插入BAC的拷貝數。當誘導轉基因克隆分化時，XIST被適當地上調，盡管程度不同，而XACT表達傾向于在分化時降低，類似于在人體中觀察到的。在維持XACT表達的細胞群中，我們觀察到XIST包被染色體的選擇存在顯著偏差，XIST優先從R1和T9克隆中不攜帶XACT的X上調。然而，在T1克隆中（如在FGD1 BAC整合在X上的克隆中，圖S4D），XIST能夠在轉基因和野生型（WT）X染色體上類似地積累。我們發現XACT占據的核體積與其偏向XIST表達的能力相關。R1和T9克隆中的XACT核體積與初始hESC中的XACS核體積相同，并且顯著高于T1克隆中的XACS核體積。T1和T9克隆之間的比較特別相關，因為它們共享XACT的相同插入位點。我們的數據表明XACT在一條X染色體上的強烈積累直接影響XIST在順式中的表達或定位。

    在這里，通過將多能性的幼稚狀態與人類胚胎進行基準測試，我們已經證明人類的前XCI狀態的特征在于XIST和XACT在活性X染色體上的同時積累。這種情況與小鼠完全不同，突出了跨物種的表觀遺傳調控的可塑性以及lncRNA對物種特異性的貢獻。

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