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      資訊動態

      Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

      文字:[大][中][小] 2018/10/23     瀏覽次數:    

      Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

      lncRNA lncKdm2b通過啟動Zfp292表達來持續維持ILC3細胞

      期刊Nat.Immunol.;影響因子21.809              

      發表單位:中國科學院                                                           

                         


      導 讀

          LncKdm2b表達通過激活轉錄因子Zfp292促進其增殖,從而持續ILC3的維持。



      摘 要

         在這項研究中,我們觀察到一個不同的長非編碼RNA,lncKdm2b,在腸組3ILCsILC3s)中高水平表達。造血系統中的LncKdm2b缺乏導致ILC3的數量和效應功能的減少。LncKdm2b表達通過激活轉錄因子Zfp292促進其增殖,從而持續ILC3的維持。在機制上,lncKdm2b將染色質組織者Satb1和核重構因子(NURF)復合物募集到Zfp292啟動子上以啟動其轉錄。敲除Zfp292Bptf也減弱了ILC3的維持,導致易受細菌感染。因此,我們的研究結果表明,lncRNA可能代表ILC發展和功能的另一層調節。

       


      研究背景

          ILC根據其特征效應細胞因子可分為三組,類似于CD4+輔助T細胞亞群的分類:ILC1s、ILC2、ILC3s。ILC3與其他ILC一起來源于最早的祖細胞(α-LP(淋巴祖細胞)細胞,表達整合素α4β7CXCR+CLPs),其分化成受限制的常見輔助樣先天淋巴祖細胞(CHILP)。下游常見ILC前體(ILCP)的特征在于轉錄因子PLZF的表達,并且可以產生ILC1,ILC2ILC3亞組。越來越多的證據表明ILC3譜系規范是由命運決定轉錄因子控制的。例如,RORγt(由Rorc編碼)驅動ILC3與其前體ILCP的區別。Rorc缺失導致ILC3完全喪失,但不會導致ILC1ILC2缺失。此外,芳烴受體在ILC3中以高水平表達,并且是維持ILC3所必需的。ILC3的開發和維護也需要GATA-3。然而,它調節ILC3開發和/或維護的潛在機制仍然是難以捉摸的。

       


      結 果


      1   LncKdm2b缺乏會損害ILC3的維護

          我們鑒定了胚胎干細胞多能性維持所需的無特征的lncRNA,我們稱之為lncKdm2b。LncKdm2b缺陷導致早期胚胎致死。我們觀察,lncKdm2b在小鼠的固有層淋巴細胞(LPL)中以高水平組成型表達。然后,我們檢測淋巴祖細胞和淋巴細胞中的lncKdm2b表達,發現ILC3群體中的高lncKdm2b表達,并通過RNA熒光原位雜交得到證實。我們通過CRISPR-Cas9技術建立了lncKdm2bflox/flox小鼠。將lncKdm2bflox/flox小鼠與Rorc-Cre小鼠雜交以從ILC3s有條件地刪除lncKdm2b來生成lncKdm2bflox/floxRorc-Cre+(以下稱為lncKdm2b-/-)小鼠。我們觀察到,lncKdm2bflox/floxRorc-Cre-(下文中稱為lncKdm2b+/+)同窩對照小鼠相比,該lncKdm2b缺失導致所有ILC3亞群的數量顯著減少。我們通過原位免疫熒光染色驗證了這些觀察結果,表明lncKdm2b參與ILC3的維持。

       


      2   lncKdm2b缺乏抑制ILC3增殖

          我們觀察到的ILC3數量減少可能是由細胞死亡增加和/或細胞群擴大減少引起的。為了評估體內ILC3s的周轉率,我們給小鼠施用BrdU3天,然后對來自小腸的組織進行流式細胞術以測量攝取。我們注意到來自lncKdm2b-/-小鼠的ILC3s比同窩對照小鼠的ILC3s吸收的BrdU少得多。我們接下來分離野生型和lncKdm2b缺陷的ILC3,用CFSE標記它們,并進行體內增殖測定。我們觀察到與野生型ILC3相比,lncKdm2b缺陷型ILC3的增殖顯著降低。類似地,lncKdm2b缺陷型ILC3Ki67+細胞的頻率遠低于野生型ILC3中的頻率。我們觀察到lncKdm2b過表達恢復了lncKdm2b缺乏-受損的增殖。然而,lncKdm2b缺陷小鼠中活性caspase-3+ILC3的百分比與野生型小鼠中的百分比相當,這表明lncKdm2b缺陷的ILC3不經歷凋亡??傊?,這些發現使我們得出結論,lncKdm2b調節ILC3s的增殖,但不調節細胞凋亡。

       


      3   lncKdm2bSatb1相關聯

          我們用來自小鼠LPL裂解物的生物素標記的lncKdm2b進行RNA pull-down測定,以鑒定潛在的lncKdm2b相關蛋白。通過RNApull-down和質譜法鑒定Satb1(基因組組織蛋白)在LPL中與lncKdm2b結合。我們通過RNApull-downRNA反義純化進一步驗證了lncKdm2bSatb1的相互作用,然后進行免疫印跡分析,以及通過RNA免疫沉淀測定。Satb1LPL中以高水平表達,而相關蛋白Satb2不可檢測。此外,通過RNA-FISH測定顯示lncKdm2bILC3細胞核中的Satb1共定位。我們通過結構域作圖鑒定了相互作用位點,發現lncKdm2b的特異性片段(nt450-700)是結合Satb1蛋白所必需的。我們通過RNA電泳遷移率變動分析(RNA-EMSA)進一步驗證了該lncKdm2b片段與Satb1的結合。這些結果表明lncKdm2b直接結合ILC3中的Satb1蛋白。



      4   lncKdm2b激活Zfp292表達

         為了進一步確定哪些靶基因受lncKdm2b調節,我們進行了lncKdm2b+/+ILC3slncKdm2b-/-ILC3s的轉錄組微陣列分析。在十大下調轉錄因子中,我們關注的是一種未表征的轉錄因子Zfp292,其表達減少了五倍。我們通過實時定量PCRRT-qPCR)和免疫印跡驗證了ILC3Zfp292的下調。值得注意的是,Zfp292優先在ILC3中表達。我們使用生物素標記的lncKdm2b探針通過RNA純化(CHIRP)分析進行染色質分離。我們發現lncKdm2b沉積在Zfp292啟動子的特定區域(nt-1,200-600)上。此外,我們分離了ILC3Lin-CD45loCD90hi)并進行了染色質免疫沉淀(ChIP)和DNaseI可及性測定。我們發現lncKdm2b-/-ILC3sZfp292啟動子的這個區域(nt-1,200-600)在組蛋白活性標記物Lys4H3K4me3)的組蛋白H3的三甲基化中富集較少,但對于組蛋白抑制標記物H3K27me3更多。因此,lncKdm2b缺失導致Zfp292啟動子上較少的RNA聚合酶II富集,因此對DNaseI消化具有更強的抗性。這些數據表明lncKdm2b激活ILC3中的Zfp292表達。

       


      5   lncKdm2bSatb1NURF募集到Zfp292啟動子上

          我們制備了野生型和lncKdm2b缺陷的LPL裂解物,并將它們應用于固定化的抗Satb1用于色譜法。我們通過SDS-PAGE解析洗脫的級分,然后進行銀染和質譜分析。我們鑒定了lncKdm2b+/+lncKdm2b-/-LPL裂解物中的主要差異條帶,如BptfSnf2l,它們是NURF染色質重塑復合物的一部分???/span>-Satb1lncKdm2b+/+LPL裂解物中的NURF復合物共沉淀,但在lncKdm2b-/-LPL裂解物中不存在。lncKdm2b的加入增強了Satur1BptfNURF復合物的核心組分)之間的相互作用,而沒有lncKdm2b,Satb1不與Bptf結合。我們用抗Bptf進行了ChIP測定。我們發現Bptf富集在ILC3中的Zfp292啟動子上。然而,lncKdm2bSatb1的缺失消除了這種現象。此外EMSA顯示lncKdm2bSatb1,BptfZfp292啟動子區域形成復合物,而用RNaseARNaseH處理則消除了該復合物的形成。因此,Bptf缺失基本上抑制Zfp292表達,與Satb1缺陷細胞裂解物中的觀察結果一致??傊?,這些數據表明lncKdm2bSatb1NURF復合物募集到Zfp292啟動子上以觸發其表達。



      6   Zfp292缺乏會損害ILC3維持和功能

          我們通過CRISPR-Cas9方法建立了Zfp292缺陷型小鼠。我們發現與野生型小鼠相比,Zfp292缺失顯著降低了ILC3的數量。此外,Zfp292過表達恢復了Zfp292缺失導致的ILC3增殖受損,表明Zfp292ILC3調節所必需的。值得注意的是,Satb1Bptf的缺失抑制了ILC3的增殖。在Satb1缺陷型和Bptf缺陷型小鼠的腸中,ILC3數確實減少。與野生型小鼠相比,lncKdm2b-/-Satb1-/-Bptf-/-ILC3中的Zfp292過表達拯救了ILC3增殖。更重要的是,Zfp292-/-LPL中的lncKdm2b過表達不能挽救ILC3增殖,而Zfp292+/+LPL中的lncKdm2b過表達確實促進了ILC3增殖。因此,Zfp292-/-小鼠肯定易受C.rodentium感染。最后,與其同窩野生型對照小鼠相比,lncKdm2b-/-Zfp292-/-小鼠表現出大大減少的ILC3數量,以及對細菌感染的更大易感性??傊?,Zfp292在調節lncKdm2b介導的ILC3維持中起關鍵作用。



      討 論

          在這項研究中,我們證明lncKdm2b在腸ILC3s中以高水平表達。造血系統中的LncKdm2b敲除導致ILC3的數量和效應功能的減少。此外,我們觀察到lncKdm2b不影響ILC3的發展,但確實通過促進ILC3的增殖來維持ILC3的維持。從機制上講,lncKdm2bSatb1NURF復合物募集到Zfp292啟動子上以啟動其轉錄。Zfp292Bptf的缺失也消除了ILC3的維持,導致對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的易感性。


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