Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes

circAGO2通過HuR阻止AGO2-miRNA復合物的形成來促進癌癥進展

    期刊：Cell Death Differ.；影響因子：8

    發表單位：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院

    本文介紹了一種circRNA可以結合HuR蛋白，促進HuR在靶基因的3'-UTR富集，阻止AGO2結合，從而調控靶基因的穩定性，進而起到促進癌癥進展的作用。

    AGO2是miRNA誘導的沉默復合物的核心成分，在腫瘤發生和侵襲性中起著重要的作用。我們鑒定了一種由circAGO2產生的circRNA作為AGO2-miRNA復合物和癌癥進展的新型調節因子。機制研究揭示circAGO2機理上與人抗原R（HuR）蛋白相互作用，以促進其對靶基因的3'非翻譯區的激活和富集，導致AGO2結合的減少和AGO2/miRNA介導的與癌癥進展相關的基因沉默的抑制。

    最近的研究表明，AGO2在許多類型的癌癥中異常表達，例如胃癌，結腸直腸癌，前列腺癌和神經母細胞瘤，并且調節癌細胞的增殖，遷移和侵襲，表明AGO2在人類癌癥的發展和進展中具有重要的作用。然而，調節AGO2在腫瘤發生和侵襲性中的功能的機制仍然是難以捉摸的。

    環狀RNA數據庫circBase中AGO2基因來源的circRNA有六種，在胃癌AGS細胞中可檢測到兩種。一種circRNA（hsa_circ_0135889）稱為circAGO2，在胃癌，結腸癌，前列腺癌組織中高于癌旁組織。通過使用不同引物和Sanger測序的RT-PCR驗證了由AGO2的部分第一內含子組成的391-nt circAGO2的環化。亞細胞分級和RNA熒光原位雜交（FISH）測定表明癌細胞中circAGO2的細胞質和核富集和定位。此外，在Northern印跡分析表明癌細胞系中檢測到circAGO2高表達。這些結果表明circAGO2在癌組織和細胞系中上調。

    建立靶向circAGO2連接的表達載體和短發夾RNA（shRNA）并穩定轉染到癌細胞中，分別導致其過表達或敲除。circAGO2的異位表達或沉默分別增加和降低胃癌細胞系MKN-45和AGS的不依賴于錨定的生長和侵襲能力。此外，癌細胞形成的皮下異種移植物的生長，體積和重量分別通過穩定過表達或敲低circAGO2而顯著增加和減少。用尾靜脈注射circAGO2過表達或敲低細胞也證明circAGO2表達與腫瘤遷移相關。這些數據表明circ-AGO2在腫瘤發生和侵襲性中發揮致癌作用。

    進行了生物素標記的線性或環狀RNA下拉，然后對AGS細胞中的RNA相關蛋白復合物進行蛋白質組學分析。質譜分析顯示存在767種與circAGO2作用的蛋白，并與RBPDB數據庫和AGO2結合蛋白建立的RBP重疊，發現四個潛在的circAGO2相互作用的蛋白。進一步RNA下拉和蛋白質印跡分析表明circAGO2只與HuR相互作用。電泳遷移率改變分析（EMSA），GST融合標簽Pull-down， FISH共定位分析也證明了circAGO2與HuR相互作用。

    通過RNA-seq在用circAGO2穩定轉染的MKN-45細胞中觀察到624個差異表達的基因，257個上調和367個下調。使用HuR CLIP-seq數據集的重疊分析揭示了在其3'-UTR內具有富含AU的元件的132個靶基因，其中以下基因EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4和SLC44A4與癌癥進展相關，RIP測定表明HuR或AGO2與上述基因的3'-UTR的內源結合。敲除HuR降低了HuR和AGO2對靶基因3'-UTR的內源富集，并且消除了MKR-45細胞中circAGO2異位表達誘導的HuR結合增加和AGO2富集減少。敲除HuR或轉染miRNA模擬物抑制靶基因3'-UTR報告基因的活性，其通過circAGO2的異位表達或miRNA結合位點的突變而消除。總之，這些發現表明circAGO2促進癌細胞中AGO2-miRNA復合物的HuR抑制功能。

    HuR的敲低或異位表達導致mRNA穩定性和靶基因EIF4EBP3，HNF4A，MAP4K1，NOTCH4，SLC2A4和SLC44A4的表達顯著降低或增加，其分別通過MKN-45和AGS細胞中circAGO2的過表達或沉默而被拯救。在軟瓊脂，劃痕和基質膠侵襲測定中，用sh-HuR＃2或HuR穩定轉染的癌細胞分別呈現生長，遷移和侵襲性的降低或增加。這些數據表明，circAGO2通過激活癌細胞中的HuR而具有致癌性質。

    慢病毒介導的sh-circAGO2＃1處理的異種移植物中，circAGO2、EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4和SLC44A4的腫瘤內表達顯著下調。在癌癥轉移的治療實驗中，施用慢病毒介導的sh-circAGO2＃1降低了肺轉移集落并增加了裸鼠的存活概率。這些結果表明慢病毒介導的circAGO2敲低抑制了體內腫瘤發生和侵襲性。

    我們設計了一種細胞穿透肽，命名為長度為13個氨基酸的HuR抑制肽（HIP-13），來阻止circAGO2-HuR的相互作用。用熒光素異氰酸酯（FITC）標記的HIP-13處理AGS細胞導致肽在細胞質內明顯聚集。生物素標記的肽下拉測定揭示了HIP-13與內源circAGO2的結合。施用HIP-13抑制AGS細胞的活力，生長和侵襲。尾靜脈施用HIP-13顯著減少肺轉移集落并增加用尾靜脈注射AGS細胞處理的無胸腺裸鼠的存活概率。

    在81個原發病例中，與未轉移的患者相比，轉移的胃癌組織中觀察到更高水平的circAGO2或HuR。含222例組織微陣列的免疫組織化學染色顯示胃癌中HuR高表達，與病理分級，局部浸潤，淋巴結轉移或晚期腫瘤淋巴結轉移（TNM）階段有關。此外，來自Kaplan-Meier繪圖儀（http://kmplot.com/analysis）的良好定義的胃癌病例的Kaplan-Meier生存圖顯示HuR、EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4或SLC44A4的高表達與患者的較低總體（OS）和第一進展（FP）存活概率相關。這些結果表明，circAGO2和HuR高表達，并且與胃癌的不良預后相關。

    總之，我們首次證明了circAGO2在癌組織中上調，并與患者的預后不良有關。CircAGO2通過促進其從細胞核向細胞質的轉運而與HuR相互作用并激活HuR，由此HuR抑制AGO2/miRNA介導的基因沉默，從而促進腫瘤發生和侵襲性。本研究擴展了我們對circRNA調控AGO2/miRNA功能的認識，并提出circAGO2和HuR可能是人類癌癥的潛在治療靶點。

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