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Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis
FBXW7環狀RNA在抑制膠質瘤腫瘤發生中的新作用
期刊：J. Natl. Cancer Inst.；影響因子：11.238
發表單位：中山大學附屬第一醫院
導 讀
circRNA翻譯蛋白質，并抑制腫瘤進展。
摘 要
circ-FBXW7在正常人腦中大量表達。circ-FBXW7編碼一種新的21kDa蛋白質：FBXW7-185aa。FBXW7-185aa在癌細胞中的上調抑制了增殖和細胞周期加速，而FBXW7-185aa的敲低在體外和體內促進了惡性表型。FBXW7-185aa通過拮抗USP28誘導的c-Myc穩定化來降低c-Myc的半衰期。
背景介紹
環狀RNA（circRNA）是在真核基因組中廣泛存在的RNA轉錄物。近期的證據表明，circRNA在組織發育，基因調控和癌發生中起重要作用。然而，盡管近期報道了幾種circRNA的翻譯，但是circRNA是否編碼功能性蛋白仍然是難以捉摸的。
結 果
1 人膠質母細胞瘤及相鄰正常組織中不同的circRNA表達模式
我們對來自10對臨床膠質母細胞瘤組織及其癌旁組織混樣成1個腫瘤組織、1個癌旁組織，進行了circRNA-seq分析，然后進行find_circ鑒定circRNAs，并與circBase數據庫比對。我們接下來使用RefSeq數據庫注釋這些已識別的候選者。鑒定的circRNA的染色體分布在癌組和正常組之間沒有顯著差異，而癌組中circRNA的總表達被下調。我們專注于在癌組和正常組之間具有大的差異表達的候選物，并將它們與circRNADb匹配。在這些特異性候選物中，由FBXW7基因的外顯子3和外顯子4的環化形成的novel_circ_022705引起了我們的注意。
2 將circ-FBXW7鑒定為環狀RNA
設計收斂和發散引物，其特異性擴增FBXW7的經典或反向拼接形式，驗證了FBXW7基因的外顯子3和4形成內源性circRNA。接下來，使用Sanger測序確認circ-FBXW7連接。我們發現反向拼接形成620 nt circ-FBXW7而不是Circbase中報道的1227 nt circ-FBXW7，很可能是由于內含子序列剪切。合成的circRNA表達載體成功過表達circ-FBXW7，由剪接受體（SA）和供體（SD）的側翼重復序列誘導，對于缺乏下游側翼序列的對照載體未觀察到。利用FISH分析進行circ-FBXW7細胞定位，不同細胞組分的q-PCR分析證實circ-FBXW7主要位于細胞質中（注意：此處發現該circ與circbase的不一致，測序得到的circ長度與circbase不一致時，要好好實驗確認，circbase的結果是軟件導出的，未經實驗驗證的）。
3 Circ-FBXW7編碼能力評估
在circ-FBXW7中存在潛在的跨越連接ORF，5'-帽獨立翻譯需要內部核糖體進入位點（IRES）。使用雙熒光素酶載體系統驗證了circ-FBXW7中潛在的IRES活性，表明circ-FBXW7 IRES可以誘導5'-帽獨立翻譯。隨后建立一組載體以確認circ-FBXW7可在人體細胞中翻譯，并在陽性對照中添加FLAG標簽。FLAG標簽抗體僅在circ-FBXW7-FLAG-和FBXW7-FLAG-轉染的細胞中檢測到約22kDa蛋白質，表明circ-FBXW7-FLAG載體被翻譯。然后使用液相色譜串聯質譜儀進一步表明該新蛋白（FBXW7-185aa）由circ-FBXW7編碼。
4 FBXW7-185aa對膠質瘤細胞的作用及其分子機制
建立穩定的circ-FBXW7過表達U251和U373細胞，其中IRES序列突變但載體可以與circ-FBXW7形成相似的circRNA的IRES突變載體用作陰性對照。與其對照細胞相比，穩定過表達U251和U373細胞的Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG表現出大量G1期阻滯，并且存活率降低。特異性shRNA敲低circ-FBXW7降低了FBXW7-185aa的表達，增加了細胞周期加速和細胞活力。表明FBXW7-185aa，但不是circ-FBXW7，可誘導細胞周期停滯并減少膠質瘤細胞的增殖。
我們發現c-Myc的表達在circ-FBXW7-和FBXW7-185aa-過表達細胞中也降低，半衰期測試表明FBXW7-185aa可以使c-Myc去穩定化。體內和體外泛素化測定顯示FBXW7-185aa過表達拮抗USP28誘導的c-Myc的去泛素化和增加的c-Myc遍在蛋白化。然而在Hs683和SW1783細胞中，如果FBXW7α被敲低，FBXW7-185aa的過表達不能降低c-Myc，表明FBXW7-185aa通過FBXW7α調節c-Myc。表明FBXW7-185aa與USP28競爭性地相互作用并“釋放”FBXW7α以降解c-Myc（注意：關聯重要轉錄因子Myc)。
5 circ-FBXW7和FBXW-185aa的臨床意義
在38對組織中，膠質母細胞瘤組織中circ-FBXW7表達與配對的相鄰非癌組織相比較低。同時，與低circ-FBXW7表達的患者相比，具有更高表達的膠質母細胞瘤患者（38名患者中的8名，21.1％）具有增加的總存活時間。與對照細胞相比，穩定過表達U251和U373細胞的circ-FBXW7表現出低得多的致腫瘤性。此外，穩定過表達U251和U373細胞植入小鼠的circ-FBXW7比對照小鼠壽命更長（每組5只小鼠）。
討 論
該研究僅限于培養細胞和異種移植動物模型。circ-FBXW7和FBXW7-185aa的臨床意義也可能需要通過更多實驗得到解決。此外，雖然腫瘤抑制作用是確定的，但FBXW7-185aa的臨床應用還有很長的路要走。
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