Twist1 Regulates Vimentin through Cul2 Circular RNA to Promote EMT in Hepatocellular Carcinoma

Twist1通過Cul2環狀RNA調節波形蛋白，促進肝細胞癌的EMT

    期刊：Cancer Res.；影響因子：9.13

    發表單位：南開大學

    circRNA機制研究中，轉錄因子 --> circRNA表達 --> 吸附miRNA --> 促進靶基因表達 --> 上皮-間質轉化。本微文提供Twist所有潛在靶基因列表信息，可在文末回復下載。

    Twist是一種關鍵的上皮-間質轉化（EMT）誘導轉錄因子，可增加波形蛋白的表達。在這里，我們報道Twist1可以轉錄激活Cullin2（Cul2）環狀RNA的表達，進而吸收靶向波形蛋白的miRNA，以增加EMT中波形蛋白的表達。

    上皮-間質轉化（EMT）對腫瘤轉移至關重要，并且涉及細胞重編程過程，其中上皮細胞顯著改變其形狀，表現出增加的運動性并獲得間充質表型。有證據表明Twist1上調了EMT中波形蛋白的表達，但調控機制尚不清楚，波形蛋白啟動子上沒有確定的Twist1結合位點。

    通過染色質免疫沉淀（ChIP）進行深度測序（ChIP-seq）發現Twist1直接與Cul2啟動子結合。雙熒光素酶報告系統來檢測到Twist1能夠激活Cul2啟動子的活性。分析75個HCC組織樣品后發現在轉移性和非轉移性HCC組織中Cul2的表達沒有顯著差異。在circRNADb上預測了幾個circRNA并在轉移性和非轉移性HCC組織中檢查了7種circRNA的表達。發現與非轉移性HCC相比，轉移性HCC中來源于Cul2基因的circ-10720表達持續且顯著增加。circ-10720表達水平隨著381個HCC組織中臨床分期和病理分級的進展而增加。Kaplan-Meier存活曲線顯示，circ-10720表達升高表明HCC患者的存活率較低。（注意：此處為什么選擇Cul2基因的circ?單純的circRNA 要預測其功能是極其困難的，我們可以假設重要基因來源的circRNA同樣會有重要的功能。Cul2是多種ECS（ElonginB/C-CUL2/5-SOCS-box蛋白）E3泛素-蛋白連接酶復合物的核心成分，其介導靶蛋白的泛素化。）

    Cul2位于染色體10中，并且circ-10720由外顯子6至外顯子12產生。在Twist1過表達的PLC細胞中circ-10720的表達增加，在Twist1敲低的SMMC-7721細胞中表達降低。設計靶向circ-10720的反向剪接序列的siRNA，使用掃描電子顯微鏡觀察發現在circ-10720過表達的PLC細胞中，細胞偽足增加并且細胞形態轉變為間充質表型，而在circ-10720耗盡后SMMC-7721細胞變為上皮樣細胞。此外，我們發現circ-10720促進了PLC細胞的增殖，遷移和侵襲，并且circ-10720敲低抑制了細胞遷移和侵襲?？傊?，Twist1促進了circ-10720表達，并且circ-10720在HCC細胞中起著致癌作用（注意：circ的表達依然受到轉錄因子的調控，而且與其來源基因所受的轉錄因子調控或許一致，可以因此尋找上調調控因子）。

    在CircInteractome數據庫中進行了背景評分百分位篩選出14種miRNA。使用熒光素酶報告系統發現當相應的靶位點在熒光素酶報告基因中突變時，用miRNA轉染對熒光素酶活性沒有顯著影響，表明circ-10720可以作為這些miRNA的海綿起作用。進行功能喪失測定、Western印跡以及免疫熒光分析檢查Twist介導的波形蛋白調節是否通過circRNA發生，結果顯示Twist1增強了波形蛋白表達水平，而在Twist1過表達PLC細胞中circ-10720敲低抵消了Twist1對波形蛋白表達的促進作用。此外，circ-10720敲低抵消了由Twist1過表達誘導的增強的細胞增殖，遷移和侵襲。

    建立PDTX模型，使用qRT-PCR檢測來自HCC患者的腫瘤組織中的Twist1表達水平，分為Twist1-Low和Twist-High組。Twist1-Low組的一半小鼠腫瘤內注射攜帶circ-10720的慢病毒顆粒，Twist1-High組的一半小鼠腫瘤內注射si-circ-10720。Twist1-Low腫瘤中circ-10720的過度表達增加了腫瘤體積。在Twist1-High腫瘤中敲低circ-10720阻斷了Twist1對腫瘤生長的促進作用。高Twist1表達水平顯著增加波形蛋白表達水平，但circ-10720敲低抵消了Twist1對波形蛋白表達的促進作用。

    用DEN處理TetOn-Twist1小鼠誘導產生HCC，然后將所有發生HCC的小鼠隨機分成兩組。一組喂無doxycycline水，第二組喂有doxycycline水(Twis1t組) ，促進Twist1表達（Twist組）。7天后，Twist1組中的一半小鼠通過靜脈注射（Twi+si-circ-10720組）用si-circ-10720處理，另一半用siRNA對照處理（Twi+siRNA）。測定小鼠肝臟表面上的腫瘤結節數。結果顯示doxycycline處理的小鼠顯示出顯著增加的腫瘤數量，并且注射si-circ-10720的小鼠顯示出抵消結果。在Twi+siRNA ctrl組中，Twist1和波形蛋白在肝腫瘤組織中的表達水平增加，而circ-10720敲低阻斷了Twist1對波形蛋白在Twi+si-circ-10720組中的影響。

    使用FISH分析了381個HCC樣本的circ-10720表達水平，相關性分析顯示circ-10720和波形蛋白的表達水平正相關（r=0.439，P=0.000）。Kaplan-Meier分析顯示，在75例HCC患者中，circ-10720/波形蛋白的陽性表達與較短的總體存活率相關。此外，我們發現circ-10720表達水平與HCC病例臨床分期或病理分級之間的正相關。高circ-10720組中AFP水平顯著高于低circ-10720組。表明circ-10720與預后不良和腫瘤進展相關，并且它可能作為HCC的潛在生物標志物。

    我們的數據揭示了Twist1對circ-10720介導的波形蛋白的調節以及在EMT期間circRNA的重要作用。這些發現可能有助于開發基于circRNA的惡性癌癥診斷和治療策略。

    本文研究了轉錄因子Twist1對Cul2的調控作用，Twist1更多靶基因預測列表，可按下列方式回復獲取。

    上海生因生物專業提供基因組測序、微生物測序、轉錄組測序（RNAseq），高通量測序數據標準分析、個性化分析，各類圖表繪制，及GEO、TCGA數據挖掘服務。有需要的聯系我們。

其他相關文獻解讀

文獻解讀：circRNA翻譯蛋白質，并抑制腫瘤進展

文獻解讀：circAGO2通過HuR阻止AGO2-miRNA復合物的形成來促進癌癥進展

文獻解讀：circRNA搶mRNA飯碗了？

文獻解讀：從miRNA入手尋找ceRNA機制分子circRNA（二）

文獻解讀：從miRNA入手尋找ceRNA機制分子circ/lncRNA

文獻解讀：體外合成circRNA海綿吸附miRNA治療癌癥

文獻解讀：circRNA-蛋白質相互作用介紹