Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma

環狀RNA cSMARCA5抑制肝細胞癌的生長和轉移

    期刊：J. Hepatol.；影響因子： 14.911

    發表單位：第二軍醫大學

    cSMARCA5通過miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長和轉移

    體內和體外數據表明cSMARCA5抑制HCC細胞的增殖和遷移。從機理上講，cSMARCA5可以通過海綿吸附miR-17-3p和miR-181b-5p促進TIMP3（一種眾所周知的腫瘤抑制因子）的表達。

    肝細胞癌（HCC）是世界上常見的惡性腫瘤之一，過去的三十年中，英國的HCC發病率翻了一番，在美國翻了三倍。很大程度上是因為轉移的傾向，5年HCC患者的存活率仍然很低，每年約有600,000名HCC患者死亡。確定轉移性HCC的預后生物標志物和治療靶點至關重要。

    我們首先使用RNA-seq分析HCC組織和癌旁組織的RNA。共檢測到13,686個不同的circRNA，排除低豐度后，鑒定了4727個circRNA。其中4214個circRNA已包含在circBase中，其他513個是新的（圖1A）。此外，4142個circRNAs由來自2322個基因的蛋白質編碼外顯子組成（圖1B），并且大多數外顯子circRNA的長度小于1,000個核苷酸（圖1C）。對比HCC文庫及ANL文庫可知236個差異表達的circRNA中，在HCC中108個被上調，128個被下調（圖1D）。通過qRT-PCR檢測部分circRNA在40對HCC和ANL組織中的表達（圖1E），與RNA-seq結果一致。

    選擇cSMARCA5用于進一步研究，因為它是差異表達的豐富的circRNA之一，其在HCC中顯著下調，但其pre-mRNA、mRNA、蛋白水平上調，表明cSMARCA5在HCC中的較低表達不僅僅是剪接的副產物并且暗示了功能性，已證明其在腫瘤細胞轉移性傳播的早期具有至關重要的意義。通過逆轉錄實驗證明cSMARCA5沒有poly-A尾。此外，cSMARCA5對RNaseR具有抗性。半衰期測量證明cSMARCA5比mSMARCA5更穩定，qRT-PCR和熒光原位雜交（FISH）顯示cSMARCA5的主要細胞質分布。

    構建cSMARCA5野生型載體及兩端片段截斷載體，發現只有野生型載體能高表達cSMARCA5，這說明了I14RC和I16RC對cSMARCA5的產生是不可或缺的。對RNA結合蛋白相關基因進行敲除發現，在敲除DHX9后，cSMARCA5明顯上調，而pSMARCA5和mSMARCA5沒有顯示出顯著變化，并且這種效應可以通過過表達野生型DHX9轉基因而不是'解旋酶死亡'突變體來挽救，表明調節依賴于其解旋酶活性。使用針對DHX9的抗體進行了RNA免疫沉淀（RIP），并觀察到I14RC和I16RC的顯著富集。此外，DHX9在HCC中明顯上調并在HCC組織中與cSMARCA5的表達負相關。

    Kaplan-Meier的存活曲線顯示，肝癌切除術后肝癌患者cSMARCA5表達較低的HCC患者總體具有較低的生存率（OS）和無復發生存率（RFS）。多變量分析表明cSMARCA5表達水平，連同AFP，腫瘤大小，病理性衛星，封裝，是OS的獨立危險因素，cSMARCA5表達水平，與AFP，腫瘤大小，微血管入侵，封裝，是RFS的獨立危險因素。

    CCK-8測定，劃痕傷口愈合和transwell遷移測定顯示過表達cSMARCA5后HCC細胞的生長和遷移顯著延遲。敲低cSMARCA5促進了HCC細胞的生長和遷移。在體內，裸鼠皮下注射cSMARCA5過表達細胞顯示腫瘤的生長被顯著抑制。將皮下腫瘤組織原位植入的肝內轉移模型發現顯著更少的肝內轉移。隨后，通過尾靜脈注射建立肺轉移模型使用體內成像系統進一步證實cSMARCA5的過表達可顯著抑制肺轉移。

    用SMMC-7721和Huh7細胞中抗AGO2的抗體進行RNA免疫沉淀（RIP），cSMARCA5被AGO2抗體顯著富集。這一結果表明cSMARCA5可能作為一個AGO2和miRNA的結合平臺。使用miRanda miRNA靶標預測工具找到65個可能與cSMARCA5結合的潛在miRNA。其中29個在人HCC或ANL中表達，結合circRIP，使用特異性針對cSMARCA5的探針，發現cSMARCA5，miR-17-3p和miR-181b-5p的特異性富集。使用這兩種miRNA進行熒光素酶測定、生物素偶聯的miR-17-3p或miR-181b-5p模擬物的下拉實驗證實了他們之間的相互作用。此外，雙FISH（熒光原位雜交）測定表明cSMARCA5和這兩種miRNA的共定位。

    分別過表達miR-17-3p和miR-181b-5p模擬物，TIMP3都下調。cSMARCA5過表達時TIMP3是顯著上調，cSMARCA5敲低時最明顯地下調。我們觀察到外源miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可顯著抑制TIMP3的表達，并且在cSMARCA5過表達后抑制被抑制。CCK-8測定、Transwell遷移測定顯示miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可以促進HCC細胞的生長和轉移，并且這種作用可以被過表達的cSMARCA5阻斷。此外，TIMP3的mRNA水平下調并且與HCC組織中cSMARCA5的表達正相關?？傊?，結果表明cSMARCA5至少部分地通過miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長和轉移。

    我們的研究表明，circRNA可能抑制HCC的生長和轉移，并作為肝切除術后肝細胞癌患者的預后生物標志物。此外，在HCC中初步證實了DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路的調節作用。我們的研究結果為進一步的肝癌中circRNA的功能，診斷和治療研究奠定了基礎。

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