Diverse Long RNAs Are Differentially Sorted into Extracellular Vesicles Secreted by Colorectal Cancer Cells

結直腸癌外泌體中差異表達的long RNAs

    期刊：Cell Reports；影響因子：8.032

    發表單位：哈佛醫學院神經病學系

    本研究對外泌體中的long RNAs使用RNAseq技術檢測表達的RNAs，發現有大量的mRNA，lncRNA存在與外泌體中。

    外泌體編碼和長非編碼RNA（lncRNAs; > 200nt）的調節和功能作用在很大程度上是未知的。我們以前發現KRAS突變型結直腸癌（CRC）細胞釋放外泌體含有不同蛋白質，microRNA和環狀RNA。在這里，我們全面識別CRC細胞EV中分泌的多種長鏈RNA，并描述他們的特征。

    RNAseq樣品選擇：含有單個WT和G13D KRAS等位基因的親本細胞DLD-1，重組產生的子細胞系含有單個WT（DKs-8），單個G13D（DKO-1）細胞。每種細胞分別測原細胞及其上清液中的外泌體。每個三重復。共計18個樣品。

    RNAseq實驗方法：采用去核糖體RNA建庫的方式，富集mRNA, lncRNA等長非編碼RNA。（也能富集到circRNA，但本文沒有展現數據。）

    對于所有細胞譜，大約70％的配對reads比對到人類基因組中的單一位置，而在EV中，比對百分比低得多（30％-50％）。

    為了進一步分析細胞和EV之間以及WT和突變體KRAS之間的總體長RNA譜是否不同，我們進行了主成分分析（PCA）。PCA顯示，當比較親本細胞RNA譜和它們分泌的EV RNA時，長RNA譜庫明顯不同（圖2A）。如果單獨比較細胞RNA表達模式，在各種培養條件下，大概按KRAS狀態分離（圖S2）。外泌體的不同分組混在一起，分離度較差。（注意：我們可以看出細胞是相對穩定，彼此大約可以分開。但外泌體不能分開。說明外泌體較復雜，或許需要更多的樣品尋找規律）。

    在EV中上調的絕大多數長鏈RNA在所有三種同基因系（12,814種RNA）中共享，表明這些RNA的輸出機制主要與KRAS無關。這與我們在先前的miRNA譜中觀察到的相反，其中大多數RNA在DKO-1 EV中被上調。

進行獨特上調的exRNA的基因本體論（GO）分析以更好地理解EV RNA信號傳導的可能影響。有趣的是，約5,000個EV RNA不能唯一地分配到特定的GO類別，這表明大量未注釋的RNA被特異性地輸出到EV中，并且它們的潛在功能尚未被了解。

    我們檢測到了許多源自EV中的mRNA的reads。其中一些在腫瘤發生中具有已知的作用，包括Rab13，NET1和NEDD4。一些mRNA具有全長mRNA reads分布模式，Rab13和BMI1的數據支持成熟的完整mRNA的存在。相反，來自其他mRNA（例如，Rab3b）的EV讀數不僅顯示來自外顯子的讀數，而且還顯示內含子的豐富讀數，表明未加工的，未剪接的mRNA轉錄物或更可能的RNA片段的輸出。

由于RNA-seq不能區分全長或片段化序列，我們使用qRT-PCR和RT-PCR來驗證EV中mRNA的水平，并測試EV中是否存在全長轉錄。雖然技術困難可能會抑制長RNA的逆轉錄，但我們無法擴增大多數1 kb的大多數mRNA，這表明大多數較長的mRNA可能不會作為EV中的完整mRNA存在，與以前的工作一致。有趣的是，我們無法通過RT-PCR檢測全長BMI1轉錄物，而我們能夠檢測全長Rab13和b-肌動蛋白mRNA。與細胞譜相比，任何EV制劑中肌動蛋白或mRNA水平都不富集。

    對于EV差異lncRNA的富集，我們發現許多富含EV的lncRNA與其匹配的同源細胞（包括反義RNA）和衍生自假基因的轉錄物相比較。大多數高度上調的lncRNA要么未經注釋，要么之前未進行過研究，這表明這些RNA通過導入EV可能發揮作用。

    我們再次使用transwell測定支持Rab13-HA mRNA的細胞外轉移。Rab13-HA蛋白在受體細胞中也是可檢測的，但同樣，只有當DKO-1細胞作為供體細胞時。在這種情況下，標記的蛋白質可能已經轉移到EV或Rab13-HA mRNA可能已被轉移并隨后在受體細胞中翻譯。

    為了測試lncRNA的轉移，我們開發了CRISPR-Display系統，與通過EV轉移一致，我們能夠檢測EV顆粒中的全長修飾的gRNA。表明外泌體可以轉移lncRNA。

    我們的數據支持這樣的假設：長鏈RNA輸出到EV中是一個選擇性過程，來自EV的RNA表達譜不僅僅反映細胞RNA豐度。由于最初的研究表明mRNA和蛋白質的水平轉移，幾乎所有已知類型的RNA都在細胞外液中被檢測到。然而，證明功能性長編碼和非編碼RNA轉移的確定性研究是有限的。我們顯示長的編碼和非編碼RNA可以在供體和受體細胞之間轉移，并且KRAS狀態在調節這種轉移中起作用。

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