circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma

HNF4a調節circRNA_104075刺激YAP依賴性腫瘤發生，可作為肝細胞癌的診斷標志物

    期刊：Cell Death Dis；影響因子：5.638

    發表單位：同濟大學附屬醫院

    之前我們介紹了一篇“轉錄因子→circRNA→miRNA→腫瘤基因”思路的文章“轉錄因子 --> circRNA表達 --> 吸附miRNA --> 促進靶基因表達 --> 上皮-間質轉化”，本文同樣尋找這個思路，轉錄因子HNF4a與啟動子區結合刺激circ_104075表達，circ_104075通過吸附miR-582-3p充當ceRNA以上調YAP表達進而促進腫瘤進展。另外，在研究腫瘤基因3’UTR區域結合miRNA時添加了m6A的影響，思路新穎。

    一些類型的環狀RNA（circRNA）在包括肝細胞癌（HCC）在內的人類疾病中異常表達。然而，其機制和診斷作用在很大程度上是未知的。在這里，我們發現circ_104075在HCC組織，細胞系和血清中高表達。機理上，HNF4a與circ_104075啟動子的-1409至-1401區域結合以刺激circ_104075的表達。此外，circ_104075通過吸附miR-582-3p充當ceRNA以上調YAP表達。有趣的是，在YAP 3'UTR的353-357區域中鑒定出N6-甲基腺苷（m6A）motif，并且該m6A修飾對于miR-582-3p和YAP 3'UTR之間的相互作用是必需的。

    與線性非編碼RNA相比，環狀RNA（circRNA）由于其共價閉環結構而高穩定。某些類型的circRNA在HCC患者的組織或血清中異常表達，并且它們表現出促腫瘤發生的作用。由于其在HCC發展中的關鍵功能及其相對穩定的特征，circRNA顯示出作為HCC診斷中的新型生物標志物的潛力。

    從三項關于HCC中的circRNA表達與健康組織的研究中收集微陣列數據。在Huang等人的研究中，鑒定出10個circRNA在HCC中高表達，在Fu等人的研究中鑒定出258個circRNA在HCC中高表達，并且鑒定出456個circRNA在HCC中高表達。在Han等人進行的研究中，發現只有circRNA_104075（circ_104075）在所有三項研究中都高表達（圖1a）。在評估十對臨床肝組織后，與鄰近的正常組織相比，在HCC組織中檢測到更高水平的circ_104075（圖1b）。與正常肝細胞系（THLE-3和HL-7702）相比，在已建立的HCC細胞系（Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2，Hep1和Huh7）中也觀察到circ_104075的更高表達（圖1C）。此外，我們檢測了circ_104075的水平和幾種報道的血清中的lncRNA和microRNA HCC生物標志物。我們發現，與健康個體相比，HCC患者血清中circ_104075的表達更高。這些結果證明circ_104075在HCC組織，細胞系和血清中高表達。

    為了研究circ_104075在HCC中過表達的原因，我們在肝癌細胞系BEL-7402和SMMC-7721中過表達或敲低一些國內公認的肝癌促進轉錄因子（TEAD，CREB，HNF4A，TFCP2，STAT3，C-Myc和FOXO1）。我們觀察到只有HNF4a過表達或敲低才能顯著刺激或抑制circ_104075的表達。我們還測定了臨床肝組織中HNF4a mRNA的水平，發現HCC組織中HNF4a mRNA水平高于鄰近正常組織。還鑒定了circ_104075和HNF4a之間的倍數變化的正相關，這表明HNF4a可能促進circ_104075的表達。在circ_104075啟動子的-1409至-1401區域中鑒定出HNF4a結合motif。ChIP-qPCR結果表明含有該motif的circ_104075啟動子區域（-1482至-1296）可以與HNF4a結合，而其他區域沒有表現出這種能力。這些數據證明了HNF4a刺激circ_104075轉錄。

    接下來，我們研究了HCC中circ_104075刺激哪種通路促進腫瘤。設計了circ_104075表達和siRNA載體以測試表明HCC促進信號傳導通路活性的因子的表達，包括AKT，β-連環蛋白，TGF-β，STAT3，HNF4a，YAP，c-Myc和FOXO1。我們觀察到僅通過circ_104075過表達刺激YAP的mRNA水平，并且在Bel-7402和SMMC-7721細胞中均被circ_104075敲低抑制。類似地，通過circ_104075過表達促進YAP的蛋白質表達，并通過circ_104075敲低抑制（注意：circRNA過表達尋找靶基因）。circRNA可以作為ceRNA起到吸收microRNA和間接刺激蛋白質表達的作用。我們使用生物信息學工具miRanda預測并篩選了circ_104075的候選microRNA靶標。miR-582-3p，miR-195-3p，miR-3916，miR-548u和miR-4744被預測為與circ_104075組合的5種最可能的微小RNA，具有最高的總分。使用circ_104075特異性探針在過表達Bel-7402和SMMC-7721細胞的circ_104075中進行circRNA探針沉淀，以鑒定實際上與circ_104075結合的miRNA。結果表明miR-582-3p與Bel-7402和SMMC-7721細胞中的circ_104075結合。（注意：預測circRNA結合的miRNA并驗證）。熒光素酶報告基因，表明在circ_104075和miR-582-3p預測的結合motif在它們的相互作用中起著至關重要的作用。我們進一步研究了miR-582-3p是否可以直接結合YAP mRNA的3'UTR區域。TargetScan軟件用于預測miR-582-3p和YAP mRNA的3'UTR區域中潛在的結合motif，這些motif負責它們的相互作用。熒光素酶實驗，表明YAP 3'UTR中的315-321區域可能是由miR-582-3p直接結合的motif。（注意：預測并證明YAP 3'UTR與miRNA結合）。

    m6A修飾在調節mRNA的穩定性中起關鍵作用。然而，尚不清楚m6A修飾是否會影響microRNA和mRNA之間的相互作用。設計了三對qPCR引物，其分別在YAP的3'UTR中含有三個潛在的miR-582-3p結合motif。使用抗m6A進行RNA-IP-qPCR以檢測m6A修飾的水平。熒光素酶實驗結果證明YAP 3'UTR的353-357區域的m6A修飾對于YAP 3'UTR和miR-582-3p之間的相互作用是必需的。我們還評估了HCC和鄰近正常組織中YAP 3'UTR的235-419區域的m6A修飾水平。數據顯示，與HCC組織相比，正常組織中的m6A修飾水平顯著更高。這些結果表明YAP 3'UTR中的353-357區域是m6A修飾的，并且這種修飾對于miR-582-3p發揮其YAP抑制功能是至關重要的。

    我們測量了HCC患者，健康個體和其他肝?。òㄒ倚透窝?，丙型肝炎和肝硬化），其他消化系統癌癥（包括結腸癌和胃癌），乳腺癌和肺癌患者的血清circ_104075水平。我們發現HCC患者的circ_104075水平高于健康個體和乙型肝炎，丙型肝炎，肝硬化，肺癌，胃癌，結腸癌和乳腺癌患者;該結果表明circ_104075的升高的表達對HCC是特異性的。表明circ_104075是用于診斷HCC的有希望的血清生物標志物。

    在這里，我們發現circ_104075可以吸收miR-582-3p通過YAP刺激腫瘤發生。YAP是HCC中廣泛接受的刺激物，并且發現其在HCC患者的約62％肝組織中被上調。YAP的轉基因過表達導致小鼠器官大小和最終HCC的失調。我們發現了一種新的circRNA相關通路，可刺激HCC中的YAP，并提供了YAP促進HCC發生和發展的新證據。

    我們觀察到circ_104075激活YAP作為ceRNA以吸收YAP抑制劑miR-582-3p。許多microRNA結合位點存在于各種各樣的RNA轉錄本上;因此，含有miRNA結合位點的所有RNA轉錄物可以通過競爭共享的miRNA進行通信并相互調節，并充當ceRNA。mRNA，lncRNA和假基因具有ceRNA活性。在HCC中，circRNA可以作為ceRNA起作用以刺激或抑制腫瘤發生。

    本文研究了轉錄因子HNF4a對circRNA_104075的調控作用，HNF4a更多靶基因預測列表，可按下列方式回復獲取。

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