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Exosomes from BM-MSCs increase the population of CSCs via transfer of miR-142-3p
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骨髓間充質干/基質細胞的外泌體轉移miR-142-3p增加結腸癌干細胞的數量
期刊：Br. J. Cancer；影響因子：5.922
發表單位：中國醫科大學
導 讀
骨髓間充質干/基質細胞（BM-MSCs）衍生的外泌體通過miR-142-3p促進結腸癌干細胞樣特性
摘 要
從BM-MSCs中分離外泌體，并使用這些外泌體來治療結腸癌細胞。通過細胞表面標記（CD133和Lgr5）和功能測定、基因靶標的功能和分子分析發現BM-MSC衍生的外泌體含有不同的microRNA，包括miR-142-3p，這反過來又增加了結腸癌細胞中CSCs的數量。從BM-MSC衍生的外泌體中敲低miR-142-3p明顯降低了結腸CSC的數量。機理上，發現Numb是miR-142-3p的靶基因，并且miR-142-3p通過下調Numb促進Notch信號傳導通路。
背景介紹
骨髓間充質干/基質細胞（BM-MSCs）是顯示遷移至腫瘤并參與腫瘤微環境的祖細胞。BM-MSCs通過釋放細胞因子或外泌體在腫瘤過程中發揮重要作用;然而，BM-MSCs如何影響結腸癌細胞中CSC的干性仍然知之甚少。
結 果
1 來源于人骨髓的MSC的表征
從健康個體獲得的人骨髓細胞中分離人BM-MSC。通過流式細胞儀評估的BM-MSC的純度>95％。貼壁細胞顯示出均勻的成纖維形態。在第6代（P6）BM-MSCs具有均一的表面標志物，并且對于間充質標記物（CD44，CD73，CD90和CD105）呈陽性，對造血和內皮標記物（CD34，CD11b，CD19，CD45）和HLA-DR呈陰性。P6 BM-MSC的純度約為87.4％。
2 BM-MSC衍生的外泌體的分離和鑒定
通過標準超速離心分離了源自BM-MSC的外泌體。通過粒度分析儀證明了BM-MSC衍生的外泌體的大小范圍為3.6-140nm。通過免疫電子顯微鏡確認外泌體對已知的外泌體標記CD63，CD81和RAb5A呈陽性。外泌體對CD63，CD81，Rab5A，CD9和HSP70的表達呈陽性，并且通過蛋白質印跡對細胞色素c的表達呈陰性。
3 BM-MSC衍生的外泌體增加結腸CSC的群體
用來自BM-MSC的條件培養基的外泌體處理結腸癌細胞。當用外泌體處理結腸癌細胞時，進行FCM發現CD133+和Lgr5+結腸癌細胞的表達水平增加，集落形成測定顯示集落數增加，結腸癌細胞中干細胞標志物的表達增加。細胞侵襲和致腫瘤性測定發現用外泌體處理的結腸癌細胞顯著增加細胞侵襲和致腫瘤性。BM-MSC衍生的外泌體也促進細胞粘附，對doxorubicin也表現出更大的抗藥性。表明，來自BM-MSCs的外泌體在促進結腸癌細胞的干性中起著關鍵作用。
4 外泌體miR-142-3p促進結腸癌細胞的干細胞樣表型
從microRNA陣列中，我們鑒定出50個microRNA，其中BM-MSCs衍生的外泌體增加了3倍以上。從50種microRNA中選擇了miR-142-3p，這是唯一一種促進結腸癌干細胞樣球形成和CD133和Lgr5表達的microRNA。使用定量實時PCR，我們證實來自用BM-MSC衍生的外泌體處理的結腸癌細胞的外泌體的miR-142-3p的豐度大于單獨的結腸癌細胞。
用miR-142-3p慢病毒或對照慢病毒轉染三種結腸癌細胞發現用miR-142-3p轉染的三種癌細胞比用對照轉染的細胞具有更大比例的CD133和Lgr5陽性細胞。BM-MSC衍生的外泌體中結腸癌細胞中干細胞標志物的表達增加。原位注射小鼠腸壁實驗發現miR-142-3p在體內抑制HT-29和SW-480結腸癌細胞的原發性腫瘤中的腫瘤增殖。表明BM-MSC衍生的外泌體可能通過miR-142-3p促進腫瘤的進展。
5 結腸癌細胞中外泌體的miR-142-3p的的靶基因
使用TargetScan來確定miR-142-3p靶基因并鑒定了與CSC信號傳導通路相關的幾種靶基因。通過生信分析，選擇Numb作為結腸癌中的miR-142-3p的的靶基因。雙熒光素酶報告基因測定顯示miR-142-3p的可以直接結合Numb的3'UTR，而突變體3'UTR沒有觀察到差異。定量實時PCR發現轉染miR-142-3p的結腸癌細胞中的Numb表達顯著降低。蛋白質印跡表明miR-142-3p轉染的結腸癌細胞中Numb的豐度降低。此外，抑制Numb的表達促進的Notch靶基因表達，在miR-142-3p-過表達的結腸癌細胞中逆轉Numb也可以抑制Notch信號。
6 BM-MSCs外泌體敲低miR-142-3p減弱了外泌體對結腸癌的影響
使用antagomiR-142-3p，我們降低了BM-MSCs外泌體中miR-142-3p的表達。用來自antagomiR-142-3p轉染的BM-MSC或對照antagomiR轉染的BM-MSC的外泌體處理結腸癌細胞。結果顯示，antagomiR-142-3p可下調結腸CSCs的數量。與對照antagomiR相比，antagomiR-142-3p療法相對減少細胞侵襲和粘附。耐藥性測定顯示，與來自BM-MSC的外泌體相比，antagomiR-142-3p外泌體可顯著抑制結腸癌細胞的細胞活力。表明從BM-MSCs的外泌體中剝奪miR-142-3p可以減弱外泌體對結腸癌細胞的作用。
討 論
總之，我們的工作揭示了BM-MSC衍生的外泌體調節結腸癌進展的能力爭論領域。這些數據闡明了BM-MSC衍生的外泌體通過miR-142-3p促進CSC表型的功能。我們的研究結果以及該領域的其他研究表明，BM-MSCs是更通用的細胞，通過細胞因子或外泌體對結腸CSCs表型，腫瘤形成，侵襲和化療耐藥性有貢獻。
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